Wasserstoffperoxid-abhängige Enzyme (Peroxidasen und Peroxygenasen sowie Lipasen)

Bild Forschungsprojekt

Im Allgemeinen ist Wasserstoffperoxid ein stabiles und relativ mildes Oxidationsmittelreagenz und kann als "grünes" Reagenz angesehen werden. Neben etablierten Anwendungen im Bereich der chemischen Prozesse werden immer mehr enzymatische Synthesen auf Basis von Wasserstoffperoxid entwickelt. Verschiedene Typen von enzymatischen Reaktion können durch Einsatz von Enzyme in Kombination mit Wasserstoffperoxid adressiert werden (z. B. Hydroxylierungen, Epoxidierungen, Sulfoxidationen, Halogenierungen, Baeyer-Villiger-Oxidationen, Decarboxylierungen). Um diese Reaktionen in den industriellen Maßstab zu überführen, werden molekularbiologischen und verfahrenstechnische Arbeiten am DFI kombiniert.

 

CEEPOx- Entwicklung einer Systemlösung für chemo-elektro-enzymatische Percarbonsäure-vermittelte Oxidationsreaktionen am Beispiel der Erzeugung chiraler Monoterpene

Laufzeit: 1.1.2014 - 30.6.2016
Partner: Hochschule für Technik und Wirtschaft Berlin, TU Dresden
Geldgeber: AiF
Bearbeiter: Dirk Holtmann
Arbeitsgruppe: Industrielle Biotechnologie

Generell ermöglicht die Kombination von Elektrochemie und Enzymkatalyse zu elektroenzymatischen Verfahren eine Vielzahl von zukunftsweisenden Produktionssystemen sowie Verfahren zur Schonung der Ressourcen.

Dabei werden elektrochemische Verfahren zur Erzeugung von Reaktanden sowie zur Regeneration oder Substitution von Kofaktoren genutzt. Insbesondere die Kombination von Wasserstoffperoxid-abhängigen Enzymen (Peroxidasen, Peroxygenasen, Laccasen sowie unter entsprechenden Bedingungen Lipasen und P450 Monooxygenasen) mit elektrochemischen Verfahren weist ein extrem hohes Anwendungspotential auf. Beispielsweise können Peroxidasen für verschiedene selektive Sauerstofftransfer-Reaktionen wie z.B. Hydroxylierungen oder Epoxidierungen eingesetzt werden. Aufgrund eines breiten Substrat- und Reaktionsspektrums und der Unabhängigkeit von Kofaktoren sind diese Enzyme industriell interessante und vielseitig einsetzbare Enzyme. Neben der Nutzung dieser Enzyme für Synthesen ergeben sich aus dieser Reaktionsvielfalt auch Verfahren zur Entfernung von persistenten Umweltschadstoffen beispielsweise im Abwasserbereich.

Allerdings besitzen die H2O2-abhängigen Enzyme häufig eine geringe Stabilität gegenüber dem obligatorischen Ko-Substrat Wasserstoffperoxid; dies ist ein wesentlicher Grund, weshalb die Enzyme bisher technisch nur in begrenztem Umfang eingesetzt werden. Die bedarfsgerechte elektrochemische Erzeugung des H2O2 kann dazu genutzt werden, die Zykluszahl (ttn, total turnover number) der Reaktion erheblich zu erhöhen und gleichzeitig hohe Raumzeitausbeuten zu ermöglichen. Als besonders geeigneter Elektrodentyp haben sich im Rahmen von Vorarbeiten dabei Gasdiffusionselektroden (GDE) erwiesen [1-4]. Durch die elektrochemische Steuerung der H2O2-Erzeugung gelingt es, die Konzentration des Ko-Substrates während des gesamten Reaktionsverlaufes unterhalb der Inhibierungsgrenze zu halten und trotzdem hohe Produktbildungsraten zu erzeugen. Im Rahmen des Projektes werden verschiedene Systemlösungen für den Einsatz der H2O2-abhängigen Enzyme am Beispiel von Chloroperoxidase, unspezifischen Peroxygenasen und Lipasen erarbeitet.

 1.         Getrey, L., et al., Enzymatic halogenation of the phenolic monoterpenes thymol and carvacrol with chloroperoxidase. Green Chemistry, 2014. 16(3): p. 1104-1108.

2.         Holtmann, D., et al., Electroenzymatic process to overcome enzyme instabilities. Catalysis Communications, 2014. 51(0): p. 82-85.

3.         Krieg, T., et al., Gas diffusion electrode as novel reaction system for an electro-enzymatic process with chloroperoxidase. Green Chemistry, 2011. 13(10): p. 2686-2689.

4.         Horst, A.E., K.M. Mangold, and D. Holtmann, Application of gas diffusion electrodes in bioelectrochemical syntheses and energy conversion. Biotechnology and Bioengineering, 2015.

 

Nachhaltige Synthesen mit CPO - Erhöhte Reaktionstemperatur, Reaktionen in überkritischem CO2 und neue Substrate

Laufzeit:  01.11.2013-31.10.2016
Partner: ASA Spezialenzyme
Geldgeber: BMBF
Bearbeiter: Sebastian Bormann
Arbeitsgruppe: Industrielle Biotechnologie

Das Enzym Chloroperoxidase (CPO), welches natürlicherweise vom Pilz Caldariomyces fumago sekretiert wird ist ein vielseitig einsetzbarer biokatalysator mit diversern potentiellen Anwendungsfeldern zur Oxyfunktionalisierung organischer Substrate. Im Gegensatz zu P450 Monooxygenasen, die teure Kofaktoren benötigen, nutzt CPO ausschließlich günstiges Wasserstoffperoxid als Kosubstrat.

Die geringe thermische und oxidative Stabilität von CPO verhindern den industriellen Einsatz des Enzyms. Darüberhinaus ist die Oxyfunktionalisierung von größeren organischen Substraten (> C10) in der Regel nicht möglich, da das Enzym einen Substratkanal mit geringem Durchmesser besitzt. Ziel des Projektes ist es deshalb, die thermische und oxidative Stabilität, sowie das Substratspektrum der CPO durch Enzym engineering zu verbessern.

Wir werden im Rahmen des Projekts ein heterologes Expressionssystem entwicklen, dass das Mikrotiterplatten-basierte Screening einer CPO Mutantenbibliothek erlaubt. Rationales Design soll darüber hinaus eingesetzt werden, um das Substratspektrum des Enzyms zu erhöhen. CPO-Varianten mit verbesserten Eigenschaften werden in Modellreaktionen, unter anderem zur Biokatalyse in überkritischem CO2 eingesetzt. Die Biokatalyse in diesem alternativen Lösungsmittel adressiert Löslichkeitsprobleme der meist stark hydrophoben Substrate. Im Gegensatz zu konventionellen hydrophoben Lösungsmitteln ist überkritisches CO2 nicht-toxisch, kann nachhaltig produziert und einfach entsorgt werden. Der Einsatz stabilerer CPO-Varianten in überkritischem CO2 soll somit als nachhaltige Alternative zu chemischen  Prozessen, die auf toxischen und teuren Lösungsmitteln basieren, etabliert werden.

Das Projekt wird in Kooperation mit ASA Spezialenzyme durchgeführt. ASA entwickelt und produziert diverse Spezialenzyme und verfügt über weitreichende Kentnisse im Bereich Formulierung und Anwendung von CPO.

 

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